Cytoskeleton，Inc。很高興為藥物篩選，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產(chǎn)品。我們專注于生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)和易于使用的試劑盒，以研究生物化學(xué)和細(xì)胞過(guò)程。我們的試劑盒可用于少量樣品，用于基礎(chǔ)研究或小屏幕（Biochem Kits™），也可用于大屏幕的高通量樣品（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我們現(xiàn)有的產(chǎn)品，我們還在產(chǎn)品線中為微管，微管蛋白，運(yùn)動(dòng)蛋白，小G蛋白效應(yīng)物，GAP，GEF和其他幾種蛋白提供藥物篩選服務(wù)。

Binding Proteins

結(jié)合蛋白質(zhì)

· 概述

· 關(guān)于

· CITATIONS

· 常見(jiàn)問(wèn)題解答

肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞中的多種蛋白質(zhì)相互作用
*，F(xiàn)-和G-肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞中的多種蛋白質(zhì)相互作用（14）??。目前有超過(guò)150種已知的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABP），其占細(xì)胞蛋白的約25％。ABP在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上賦予大量功能多樣性，其涉及諸如肌肉收縮，唇形突破，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，胞質(zhì)分裂和細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)的過(guò)程。研究這些過(guò)程如何調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲功能和動(dòng)力學(xué)是一個(gè)重要且不斷增長(zhǎng)的研究領(lǐng)域。

可以通過(guò)使用生物化學(xué)，遺傳學(xué)和免疫學(xué)方法分離和研究肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。因?yàn)榇嬖诔^(guò)50種類型的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，所以用于鑒定它們的方法及其功能/活性也是多種多樣的。肌動(dòng)蛋白親和柱通常用于親和純化ABP，無(wú)論它們是F-或G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合。可以通過(guò)利用芘肌動(dòng)蛋白熒光的聚合增強(qiáng)來(lái)進(jìn)行顯示潛在ABP影響肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的簡(jiǎn)單測(cè)定（參見(jiàn)測(cè)量肌動(dòng)蛋白聚合物部分）。這種性質(zhì)的研究有助于鑒定新的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。有幾篇值得一讀的關(guān)于識(shí)別和量化新肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的可能方法的評(píng)論（15,16,17）?

問(wèn)題1：哪種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABP）可用作F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合對(duì)照？ 

答案1：肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白α-輔肌動(dòng)蛋白（Cat。＃AT01）是一種F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合和交聯(lián)蛋白，使其可用作F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合研究的對(duì)照。它的Kd是1μM，這意味著在該濃度下發(fā)生50％結(jié)合。因此，我們的目標(biāo)是使用 2μM的α-肌動(dòng)蛋白作為結(jié)合測(cè)定中的陽(yáng)性對(duì)照。在結(jié)合反應(yīng)中，2μM濃度的α-輔肌動(dòng)蛋白相當(dāng)于0.23μg/μl。此外，α-輔肌動(dòng)蛋白對(duì)pH敏感，其高親和力發(fā)生在pH 7.0。

問(wèn)題2：Cytoskeleton的肌球蛋白或重的meromyosin是否具有F-肌動(dòng)蛋白活力？ 

答案2：遺憾的是，我們不會(huì)出售運(yùn)動(dòng)級(jí)肌球蛋白或重肌紅蛋白用于肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)量控制測(cè)試非常難以復(fù)制，因此我們無(wú)法充分確保試劑的質(zhì)量。因此，肌球蛋白（Cat。＃MY02和MY03）和重型meromyosin蛋白（Cat。＃MH01）不推薦用于F-肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)測(cè)定。已經(jīng)測(cè)試過(guò)這些試劑的客戶在運(yùn)動(dòng)方面沒(méi)有取得很好的成功，因此我們不建議購(gòu)買樣品進(jìn)行測(cè)試。如果需要運(yùn)動(dòng)級(jí)肌動(dòng)蛋白或重型meromyosin，我們建議遵循原始方案（Kron和Spudich，1985）并在液氮中冷凍100μl等分試樣以確保穩(wěn)定性。

    參考文獻(xiàn)：  SJ Kron和JA Spudich，1985年。熒光肌動(dòng)蛋白絲在固定在玻璃表面的肌球蛋白上移動(dòng)。PNAS，83,6272-6276。

Arp2/3 protein complex: porcine brain    Arp2 / 3蛋白復(fù)合物：豬腦

窗體頂端

2x50 ug  (Cat. # RP01P-A)

6x50 ug  (Cat. # RP01P-B

窗體底端

產(chǎn)品用途包括

· 體外肌動(dòng)蛋白聚合刺激化合物的陽(yáng)性對(duì)照

· 發(fā)現(xiàn)Arp2 / 3激活或抑制化合物

· Arp2 / 3相互作用蛋白的表征和發(fā)現(xiàn)

材料
Arp2 / 3蛋白質(zhì)復(fù)合物由7個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成，均以大致相等的化學(xué)計(jì)量比存在（見(jiàn)圖1）。Arp2 / 3復(fù)合物是肌動(dòng)蛋白絲成核的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，蛋白質(zhì)亞基在進(jìn)化上是高度保守的。蛋白質(zhì)復(fù)合物已從豬腦中純化，并以凍干粉末形式提供。當(dāng)用蒸餾水重構(gòu)，所述復(fù)合物是在以下緩沖液為：20mM Tris pH值7.5，25mM的氯hua鉀，1毫摩爾MgCl ₂，0.5mM的EDTA，0.1mM的ATP，1％葡聚糖和5％的蔗糖。Arp2 / 3復(fù)合物的分子量為224kDa。

注意：  來(lái)自procine大腦的RP01P取代牛腦中的RP01。我們比較了兩種來(lái)源的Arp2 / 3復(fù)合物的活性，并發(fā)現(xiàn)它們?cè)诩?dòng)蛋白聚合試驗(yàn)中表現(xiàn)相同（見(jiàn)圖2）

純度
通過(guò)在4-20％聚丙烯酰胺凝膠上掃描考馬斯藍(lán)染色蛋白的光密度測(cè)定法測(cè)定純度。確定Arp2 / 3蛋白質(zhì)復(fù)合物純度為90％（參見(jiàn)圖1）。

在肌動(dòng)蛋白聚合測(cè)定（Cat。＃BK003）中測(cè)試生物活性 RP01P 。結(jié)合WASP（Cat。＃VCG03）的VCA結(jié)構(gòu)域，一種Arp2 / 3激活劑，與沒(méi)有RP01的對(duì)照相比，它顯示刺激肌動(dòng)蛋白聚合20倍。這表明對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合誘導(dǎo)的Arp 2/3特異性（圖2）。

問(wèn)題1：存儲(chǔ)Arp2 / 3（Cat。＃RP01P）的*方法是什么？

答案1：  將干燥的凍干的Arp2 / 3蛋白質(zhì)（<10％濕度）保存在4°C，穩(wěn)定6個(gè)月。凍干蛋白也可以在-70°C下干燥儲(chǔ)存，在那里它可以穩(wěn)定6個(gè)月。但是，在-70°C時(shí)，管蓋上的橡膠密封可能會(huì)破裂并產(chǎn)生水分。因此，我們建議在4°C下儲(chǔ)存。如果儲(chǔ)存在-70°C，如果使用這種儲(chǔ)存條件，則必須在干燥劑中加入凍干蛋白。用10μl冷的Milli-Q水將蛋白質(zhì)復(fù)合物重懸至5mg / ml。重懸后，復(fù)合物在以下緩沖液中：20 mM Tris pH 7.5,25 mM KCl，1 mM MgCl ₂，0.5mM EDTA，0.1mM ATP，1.0％（v / v）葡聚糖和5％（v / v）蔗糖。然后將蛋白質(zhì)等分成實(shí)驗(yàn)大小的量，在液氮中快速冷凍并在-70℃下儲(chǔ)存，在此穩(wěn)定6個(gè)月。Arp2 / 3的進(jìn)一步稀釋應(yīng)在以下緩沖液中進(jìn)行：20mM Tris pH 7.5,25mM KCl，1mM MgCl ₂和1mM DTT（注意：在使用前立即將DTT加入緩沖液中）。注意：將液體氮中的Arp2 / 3蛋白快速冷凍非常重要，因?yàn)槠渌鋬龇椒〞?huì)導(dǎo)致活性顯著降低。通過(guò)置于室溫水浴中1分鐘快速除霜。避免反復(fù)凍/融循環(huán)。

問(wèn)題2：Arp2 / 3（Cat。＃RP01P）是否與肌動(dòng)蛋白聚合試劑盒（Cat。＃BK003）兼容？

答案2：  是的，Arp2 / 3與肌動(dòng)蛋白聚合試劑盒（Cat。＃BK003）配合使用可以很好地研究肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合的影響。有關(guān)其他信息，請(qǐng)參閱Arp2 / 3數(shù)據(jù)表（Cat。＃RP01P）。Arp2 / 3復(fù)合物能夠在體外以1：200的摩爾比（Arp2 / 3：肌動(dòng)蛋白）誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲的支化聚合。這種刺激在體外可觀察到聚合試驗(yàn); 然而，在典型的聚合條件下，單獨(dú)的Arp2 / 3的刺激非常低。在存在N-WASP蛋白（或N-WASP的VCA結(jié)構(gòu)域，Cat。＃VCG03）的情況下，Arp2 / 3的成核活性大大增強(qiáng)。在Arp2 / 3數(shù)據(jù)表中描述的聚合測(cè)定中，芘肌動(dòng)蛋白（Cat。＃AP05或BK003）的終濃度為0.8μM，Arp2 / 3復(fù)合物為10 nM，VCA結(jié)構(gòu)域（Cat。＃VCG03） ）是400 nM。

注意： 來(lái)自procine大腦的RP01P取代牛腦中的RP01。我們比較了兩種來(lái)源的Arp2 / 3復(fù)合物的活性，并發(fā)現(xiàn)它們?cè)诩?dòng)蛋白聚合試驗(yàn)中表現(xiàn)相同。以下測(cè)定參考Arp2 / 3蛋白復(fù)合物：牛腦（Cat.RP01）。

Leng，Y.，Zhang，J.，Badour，K.，Arpaia，E.，F(xiàn)reeman，S.，Cheung，P.，Siu，M。和Siminovitch，K。（2005）。Abelson-interactctor-1促進(jìn)WAVE2活化所需的WAVE2膜易位和Abelson介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化。PROC。國(guó)家科?？茖W(xué)院。科學(xué)。美國(guó)102,1098-1103。

van der Gucht，J.，Paluch，E.，Plastino，J。和Sykes，C。（2005）。應(yīng)力釋放驅(qū)動(dòng)基于肌動(dòng)蛋白的運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性破壞。PROC。國(guó)家科。科學(xué)院?？茖W(xué)。美國(guó)102,7847-7852。

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